Experimento 3.

Pruebas Cualitativas para aminoácidos y proteínas

Objetivos:

Al finalizar el experimento el estudiante podrá:

1.    Aplicar pruebas cualitativas generales y específicas que permitan reconocer grupos químicos de los aminoácidos y proteínas.

2.    Someter soluciones de proteínas a desnaturalización con agentes físicos y químicos.

Marco Teórico:

1. Reacción con la ninhidrina: Los grupos amino libres de los aminoácidos, de los péptidos y las proteínas reaccionan con la ninhidrina a un pH entre 4 y 8, para dar un compuesto de intenso color azul púrpura.  La prueba también es positiva con aminas primarias y amoníaco pero sin desprendimiento de CO₂ .  Los aminoácidos prolina e hidroxiprolina dan un color amarillo en lugar del color púrpura con la ninhidrina.

             La reacción es muy sensible y es ideal para la detección de aminoácidos en cromatogramas y para su cuantificación mediante técnicas espectrofotométricas de las fracciones que se obtienen de  columnas cromatográficas.

2. Reacción xantoproteica: Los aa, que contienen un núcleo aromático forman nitroderivados de color amarillo cuando se calientan con ácido nítrico concentrado.   Las sales de estos derivados son de color naranja intenso en medio alcalino.  La fenilalanina, la tirosina y en cierto grado el Triptófano, así como todas las proteínas que los contienen, dan positiva la prueba.

3. Reacción del ácido glioxílico para triptófano: El grupo indólico del triptófano reacciona con ácido glioxílico en presencia de ácido sulfúrico concentrado dando un complejo de color púrpura.  El ácido acético glacial que ha sido expuesto a la luz contiene ácido glioxílico.

4. Reacción para el triptófano: Este aminoácido se condensa fácilmente con varios aldehídos en presencia de ácidos fuertes para dar compuestos coloreados.  En la reacción se utiliza el reactivo de Ehrlich (p-dimetilaminobenzaldehído al 10% en HCL conc.) que reacciona con un buen número de compuestos orgánicos tales como indoles, aminas aromáticas y compuestos ureicos para dar complejos coloreados.

5. Reacciones para cisteína y cistina: Cuando los aa y las proteínas que contienen grupos tiólicos se calientan en medio fuertemente alcalino, el azufre presente reacciona para formar sulfuros.  Este sulfuro puede detectarse por la formación de un precipitado negro de sulfuro de plomo por adición de acetato de plomo.

Los grupos tioles también reaccionan con el nitroprusiato de sodio en presencia de un exceso de amoníaco para dar un complejo de color rojo.

6. Prueba para Arginina: El aa. Arginina contiene un grupo guanidino en la cadena lateral, este grupo reacciona con el reactivo de Sakaguchi (a-naftol/agua de Bromo) en medio alcalino para dar un compuesto de color rojo.

Pruebas generales de las proteínas:

1. Prueba de Biureth: Los compuestos que tienen dos grupos carbamidos (-CONH-), ya sea unidos directamente o a través de un átomo de carbono o nitrógeno, dan un color violeta con el sulfato de cobre alcalino (Reactivo de Biureth).  Los tripéptidos son las moléculas más pequeñas capaces de dar una prueba de Biureth positiva, mientras que esto no ocurre con los aminoácidos.

La prueba de Biureth es una buena prueba general para las proteínas y la intensidad del color violeta es una medida del número de enlaces peptídicos.  Algunas sustancias como la oxamida pueden dar falsos resultados positivos en ensayos cualitativos de proteínas.

2. Desnaturalización por calor y pH extremos: La desnaturalización es cualquier proceso por el cual el arreglo espacial de una proteína cambia de la estructura ordenada de la molécula nativa a una forma tridimensional desordenada.  Durante la desnaturalización se pierden las estructuras de orden superior de las proteínas, con pérdida de la actividad biológica.  Las enzimas por ejemplo, que realizan trabajos catalíticos en las células, tienen una temperatura y un pH óptimo en el cual presentan un máximo de actividad, pero la actividad disminuye significativamente hacia valores extremos de pH y a bajas o elevadas temperaturas.

3. Precipitación con cationes y aniones pesados y sales concentradas: Los cationes de metales pesados y los aniones de elevado peso molecular son muy usados en la separación de proteínas y en la preparación de filtrados libres de proteínas.  A pH neutro por lo general las proteínas  tienen carga neta negativa y se combinan fácilmente con iones de metales pesados que, al neutralizar la carga producen la precipitación.  A pH por debajo del punto isoeléctrico en cambio, se combinan con  aniones porque presentan carga neta positiva.  Soluciones concentradas de sales, de sulfato de amonio, por ejemplo, reducen en gran medida la solubilidad de las proteínas, porque compiten por las moléculas de agua de disponibles para la solvatación y las interacciones proteína-proteína se hacen más importantes.

Materiales:

TUBOS DE ENSAYO

GRADILLA

BAÑO MARÍA

GOTERO

Reactivos:

Soluciones al 1% en HCL IM de glicina, tirosina, triptófano, Cisteína, cistina, prolina, hidroxiprolina, arginina y fenilalanina.  Soluciones al 1% de albúmina, caseína y gelatina.  Reactivo de Beirut

HNO3 concentrado:	Se descompone lentamente por la acción de la luz, adoptando una coloración amarilla por el NO2 que se produce en la reacción. En el aire húmedo despide humos blancos, su punto de fusión es de -43 ºC y su punto de ebullición es de 83 ºC pero a esa temperatura se acentúa su descomposición. Es soluble en agua en cualquier proporción y cantidad y su densidad es de 1,5 g/mL
NaOH:	Que es muy corrosivo (tanto en solución como en sólido). Siempre que se preparen soluciones patrón de álcalis como NaOH o KOH se debe proteger la cara, así como usar guantes y ropa adecuada. Si el reactivo entra en contacto con la piel, inmediatamente lave el área con abundantes cantidades de agua. En caso de ingestión acuda lo más pronto posible a un centro de salud.
Ácido Acético glacial:		Irritaciones en vías respiratorias. Sustancia muy corrosiva. Puede provocar bronconeumonía, edemas en el tracto respiratorio. En la piel CAUSA  quemaduras. Trastornos de visión, ceguera (lesión irreversible del nervio óptico). Quemaduras en mucosas.
Acetato de plomo II:		El plomo puede formar dos compuestos con ácido acético, el acetato de plomo II y IV. Estos compuestos tienen propiedades distintas, la principal es la solubilidad en agua que presenta el acetato de plomo II, no así el acetato de plomo IV. Los dos compuestos son muy tóxicos.
Ácido Pícrico saturado:		Es una solución acuosa. En contacto con la piel: Riesgo de absorción cutánea. Irritaciones. Riesgo de dermatitis. Irritaciones en mucosas de la boca, garganta, esófago y tracto intestinal. Por ingestión de grandes cantidades: náuseas, vómitos, dolores de estómago. Efectos sistémicos: alteraciones sanguíneas, problemas hepáticos, problemas renales
Ácido Tricloroacético:		Es una solución acuosa. En contacto con la piel: Riesgo de absorción cutánea. Irritaciones. Riesgo de dermatitis. Irritaciones en mucosas de la boca, garganta, esófago y tracto intestinal. Por ingestión de grandes cantidades: náuseas, vómitos, dolores de estómago. Efectos sistémicos: alteraciones sanguíneas, problemas hepáticos, problemas renales.

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